2026年 03期
不同培养条件下CVA16病毒在KMB17细胞上的增殖特性及宿主细胞的相关转录特征分析
龙佳卿;李盈妍;于丽;郑惠文;廖芸;王晶晶;李恒;赵鑫;赵恒;李丹丹;张莹;刘龙丁;目的 手足口病（Hand, foot, and mouth disease, HFMD）是一种在儿童中高发的病毒性传染病，主要病原体为肠道病毒71型（Enterovirus A 71, EVA71）和柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16, CVA16），其中EVA71与严重神经系统并发症及死亡密切相关。随着EVA71疫苗的广泛应用，CVA16逐渐成为主要致病因子，亟需建立高效的大规模疫苗生产工艺。方法 本研究在不同温度（33℃、37℃、38.5℃）及感染复数（Multiplicity of infection,MOI:0.01、0.1、0.5）条件下，将CVA16在KMB17二倍体细胞中连续传代30次，系统评估病毒生长动力学、病毒颗粒完整性、遗传稳定性，并结合单细胞转录组分析宿主细胞应答机制，旨在为优化培养工艺参数、提升病毒产量与质量、保障疫苗生产过程提供科学依据。结果 结果显示，37℃、MOI=0.1为最佳扩增条件，病毒在24～36 h达到增殖高峰，滴度可达10~(8.0) CCID_(50)以上，且完整病毒颗粒达78%。基因组测序证实前10代VP1突变率低于0.1%，至P20和P30仍低于0.2%。单细胞分析提示接种病毒后，宿主细胞CXCL8、IER3等生长因子及内质网蛋白加工通路的应答利于促进病毒复制，后期IL6、LDHA等基因进一步上调表明病毒通过调控宿主翻译与细胞周期实现高效复制。结论 本研究表明，在37℃和MOI=0.1条件下有利于CVA16毒株在KMB17二倍体细胞的复制，为大规模生产培养CVA16提供了关键工艺参数。
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云南省昆明市2022-2023年手足口病病原谱及常见病原基因特征分析
刘泫果尔;姜黎黎;寸建萍;杨溪;伏晓庆;戚艳波;田炳均;目的 本文对2022-2023年云南省昆明市手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）病例样本进行基因测序定型并对其中常见病原体柯萨奇病毒A组4型（Coxsackievirus A4,CVA4）、6型（CVA6）、10型（CVA10）和16型（CVA16）的VP1区基因特征进行分析。方法 对2022-2023年昆明市经实时荧光定量PCR法鉴定为EVA71、CVA16或通用型阳性的161份HFMD病例粪便样本先进行VP4/VP2结合区基因测序定型，确定病毒型别。再测定各型病毒VP1区完整序列，并按文献下载CVA4、CVA6、CVA10和CVA16型病毒VP1基因代表株序列，用Mega 6.0软件构建基因进化树，进行基因特征分析。结果 2022-2023年昆明市疾控中心将经实时荧光定量PCR法检测阳性的随机抽取样本161份（2022年52份，2023年109份）送云南省疾病预防控制中心手足口病实验室进行基因测序定型，所有样本均能被扩增并测序定型，测序定型率为100%(161/161)。病毒检出率较多的依次是CVA6(48株，占29.81%,48/161)、CVA4(39株，占24.22%,39/161)、CVA10(37株，占22.98%,37/161)、CVA16(23株，占14.30%,23/161)。其他分离较少的14株病毒依次是CVA2 1株，CVB5 7株，E3 2株，PV1 2株（疫苗株），PV3 2株（疫苗株）。对这4种病毒完整VP1区基因特征分析表明，48株CVA6全为D3a亚型，39株CVA4为C2亚型，37株CVA10为基因型C,23株CVA16为B1a亚型。结论2022-2023年昆明市手足口病病原谱主要为CVA6、CVA4、CVA10和CVA16，基因特征分析表明，昆明市流行的4种主要病毒的基因型或亚型与全国其他省份一致，表明这些病毒的特定基因型和亚型在中国较长时间存在和流行，加强昆明市HFMD病原学监测和分子流行病学研究具有重要意义。
从一例住院患儿分离人偏肺病毒及其在人呼吸道上皮与肺泡类器官中感染特性研究
石小丫;陆柔剑;赵扬;余玙璠;翟程程;牛培华;宋敬东;邓瑶;谭文杰;朱娜;目的 分离一例病程超长的呼吸道感染患儿呼吸道标本中的偏肺病毒（Human metapneumovirus,hMPV），分析其体外生物学特征，验证其对广谱抗病毒药物的敏感性，以评估其进一步传播导致婴儿重症感染的风险。方法 采用气-液两相培养的呼吸道上皮类器官（Air-liquid interface human airway epithelial organoid, HAE）分离患儿咽拭子中的偏肺病毒，绘制病毒复制动力曲线；电镜检测病毒形态，免疫荧光检测偏肺病毒N蛋白在HAE表达；对所获病毒进行全基因组序列测定并进行基因标定，构建系统发育树；将分离的病毒感染肺泡类器官及常规细胞LLCMK2，测定病毒载量并观察病毒感染导致的细胞病变；同时在呼吸道类器官及LLC-MK2细胞验证该偏肺病毒分离株对广谱抗病毒药物利巴韦林的敏感性。结果 从一例病程超长的患儿咽拭子中分离获得1株人偏肺病毒临床分离株hMPV-CTan01/Beijing/2023（以下简称hMPV-CTan01），基因组全长13435 bp，属于偏肺病毒A2C亚型，与时下流行株高度一致；hMPV-CTan01能够在HAE中高效复制并产生有活性的子代病毒；HAE上清中观察到典型的偏肺病毒形态，呼吸道上皮细胞中可检测N蛋白的表达。hMPV-CTan01可以感染肺泡类器官，提示其有引发重症感染的风险；同时hMPV-CTan01在LLC-MK2细胞中良好复制，导致细胞出现典型的细胞病变，其体外特征与既往报道一致；抗病毒药物利巴韦林在细胞系LLC-MK2及HAE中均能抑制该毒株的复制。结论 从这例病程超长的患儿呼吸道分离获得的hMPV-CTan01，其体外生物学特征与既往报道一致，并未在体外展现出更强的致病性，利巴韦林能够抑制其在呼吸道类器官和LLC-MK2中的复制，提示其未出现明显的抗药性。上述结果证明，尽管hMPV-CTan01导致该患儿病程较长，但其进一步导致重症感染传播的风险较低。
儿童重症肺炎相关人腺病毒B3与B7型临床分离株的全基因组测定及体外宿主转录重塑分析
李若瑞;陆柔剑;郭小娟;赵智浩;沈军;吴长城;翟德胜;谭文杰;目的 探究人腺病毒HAdV-B3与HAdV-B7在MRC-5细胞中复制动力学、遗传特征及宿主细胞转录重构策略上的差异，并筛选可用于后续抗病毒研究的候选关联宿主因子。方法 在MRC-5细胞中比较两种毒株的增殖趋势；对6株临床分离株进行全基因组测序和演化分析；利用转录组测序（RNA-seq）分析两者感染MRC-5细胞（16hpi）后的全局转录景观；通过RT-qPCR验证候选宿主因子表达量变化。结果 在MRC-5细胞中，HAdV-B3表现出比HAdV-B7更短的复制启动周期与更早的滴度峰值趋势。全基因组分析显示6株分离株均属于HAdV-B谱系。HAdV-B3病毒转录本比例显著高于HAdV-B7(10.9%vs 1.1%)。转录组分析显示，在MRC-5细胞中，HAdV-B3对宿主转录稳态的扰动幅度显著强于HAdV-B7。功能富集揭示，两者均劫持了宿主DNA复制与细胞周期调控程序，并诱发了以IFN-β和ISG15为核心的抗病毒应答；其中，HAdV-B3在协同上调G1/S期转换（E2F8、CCNE1和PCNA）及触发复制应答（TP73）相关通路方面表现出更显著的调控效应。结论 HAdV-B3和HAdV-B7均可在MRC-5细胞中诱导显著的宿主转录重编程，但HAdV-B3表现出更强的复制活性、致细胞病变能力和宿主转录调控效应。TP73、IFN-β、ISG15、CXCL10、E2F8、CCNE1、PCNA、TK1和RRM1等基因分别关联宿主抗病毒应答及细胞周期/DNA复制重塑过程，可作为后续机制研究和药物作用靶点筛选的候选宿主因子。
2025年北京市人副流感病毒4型全基因组分析
高斌;张维嘉;吴丹;徐晖;刘医萌;石伟先;卢桂兰;崔淑娟;张代涛;赵佳琛;目的 分析2025年北京市人副流感病毒4型（Human parainfluenza virus type 4,HPIV4）的基因特征。方法 采集2025年北京市流感样病例（Influenza-like illness, ILI）咽拭子标本21002份、严重急性呼吸道感染病例（Severe acute respiratory infection,SARI）咽拭子或下呼吸道标本7570份，进行HPIV4病原体筛查。对检测为HPIV4阳性且Ct值<30的样本进行全基因组测序。采用多重PCR方法扩增HPIV4的全基因组序列，采用BioEdit软件对病毒血凝素-神经氨酸酶（Hemagglutinin-neuraminidase protein,HN）和融合蛋白（Fusion protein,F）基因的核苷酸及氨基酸变异分析，并构建全基因组、HN和F基因的系统发育树，采用NetNGlyc 1.0 Server在线工具预测HPIV4的HN和F蛋白的糖基化位点，并采用SimPlot 3.5.1软件进行重组分析。结果 HPIV4总阳性率为0.31%(81/25872),ILI与SARI病例阳性率分别为0.30%(63/21002)和0.24%(18/7570)。病毒流行高峰主要集中在夏、秋季。测序获得19条HPIV4全基因组序列，其中优势血清亚型为HPIV4b亚型C分支，占比78.95%(15/19),HPIV4a主要为C3分支，占比21.05%(4/19)。19条完整基因组序列（平均测序深度>1100x）长度约为17,300 bp左右，Q30均>85%,GC含量在35.9%～36.3%。HPIV4b的HN、F基因核苷酸同源性分别为98.28%～100.00%、97.81%～100.00%,HPIV4a的HN、F基因核苷酸同源性分别为89.26%～99.93%、99.51%～99.82%。变异分析显示，HPIV4b与HPIV4a在F蛋白发现型别特异性氨基酸变异位点。HN与F基因均受到纯化选择作用。HN蛋白存在5个潜在N-糖基化位点，F蛋白存在3个潜在N-糖基化位点；HN与F基因均未检测到重组事件。结论 2025年北京市HPIV4流行特征呈型别特异性时间分布，HPIV4b为本地优势流行血清亚型；HPIV4基因组存在型别特异性氨基酸变异位点，整体进化以纯化选择为主，未检测到基因重组现象，糖基化位点存在保守性及型别特异性差异。本研究结果为北京市HPIV4的长期监测与防控策略制定提供了重要的基因组数据支撑。
合并慢阻肺的病毒性肺炎患者预后相关危险因素及其与血清PDCD5,IFN-γ的关系
芦丹;黄莺;张薇;程方琳;杨硕;目的 探讨病毒性肺炎合并慢阻肺患者预后危险因素及其与血清程序化细胞死亡分子5(Programmed cell death 5, PDCD5)、干扰素γ(Interferon-γ, IFN-γ)的关系。方法 回顾性纳入2022年1月至2025年1月本院329例病毒性肺炎患者（慢阻肺-肺炎组85例，单纯肺炎组244例）及150例健康对照。结果 慢阻肺-肺炎组血清PDCD5、IFN-γ水平显著高于单纯肺炎组及健康对照组（P<0.05）;Logistic多因素分析显示：慢阻肺既往频繁急性加重≥2次/年、GOLD Ⅲ～Ⅳ级、需机械通气、NLR、PDCD5、IFN-γ是预后不良独立危险因素（P<0.05）,FEV_1/FVC是保护因素（P<0.05）;ROC曲线证实上述因素对预后不良均有预测价值（P<0.05）；决策树模型（以NLR为首要分层指标）分类准确率达98.0%;Pearson相关性显示：PDCD5、IFN-γ与既往频繁急性加重次数、GOLD分级、NLR呈正相关（P<0.05），与FEV_1/FVC呈负相关（P<0.05）。结论 监测危险因素可早期识别高风险患者，指导精准干预以改善预后。
一种基于荧光ELISPOT技术的高通量快速检测痘病毒中和抗体方法
张俊;刘颖;申秀丽;施宇涛;宋红婧;王书晖;目的 建立一种快速、高通量检测痘病毒中和抗体的方法。方法 对荧光斑点检测时间、病毒-抗体（血清）中和反应时间等关键参数进行优化。确定最佳反应条件，并进行方法学的系统验证。结果 确定荧光斑点检测时间为24 h，病毒-抗体中和反应时间为1 h。微量中和试验方法能准确区分已知阳性和阴性血清，在1:50至1:800稀释范围内灵敏度良好，且与噬斑减少中和试验（Plaque reduction neutralization test, PRNT）结果具有高度一致性。结论本方法将检测时间从72 h缩短至24 h，样品用量减少至原来的1/4，操作流程更易标准化，适用于痘病毒中和抗体的快速、高通量筛查。
一种巨病毒单链DNA结合蛋白Crov372的功能鉴定
郭宴菲;孙宾莲;付艳;目的 探究巨病毒中是否存在单链DNA结合蛋白（Single-stranded DNA-binding protein, SSB），并通过实验验证其功能。方法 利用原核表达系统表达并纯化Crov372蛋白，纯化的蛋白质采用Western blot验证并通过电泳迁移率实验检测其与单链DNA的结合能力；采用AlphaFold2对Crov372蛋白质进行三级结构预测，根据预测结果对该蛋白质进行截短、取代突变和缺失突变，研究Crov372蛋白与核酸结合调控的关键区域。结果 表达纯化得到Crov372蛋白，三级结构预测显示，该蛋白主要由N端的寡核苷酸结合折叠和长约100个酸性氨基酸富集的C端无序尾巴组成。电泳迁移率实验结果显示全长Crov372蛋白与单链DNA结合能力较弱；对C端进行截短后，截短体随着C端长度的变短，与核酸结合能力显著增强。对C端无序区的一段酸性氨基酸聚集区进行取代突变与缺失突变实验，结果表明减少酸性残基在C端的比例可增强结合能力，该酸性氨基酸簇在调控单链DNA结合蛋白与单链DNA结合中起关键作用。结论 本研究通过实验证实巨病毒中Crov372的单链DNA结合蛋白功能，并揭示其C端无序区对结合活性具有负调控作用，其中酸性氨基酸簇是调控与单链DNA结合的关键区域，为理解SSB蛋白在巨病毒复制中的作用提供了新线索。
用于小鼠模型肠道固有层免疫细胞亚群多色流式检测方法的建立
王倩莹;杜欣然;王硕;张俊杰;刘筱靖;甘媛;李丹;目的 针对人体肠道样本获取受限的现状，建立并验证适用于标准化小鼠模型的肠道固有层免疫细胞亚群（T细胞、B细胞、固有免疫细胞）多色流式检测方案，以支持小鼠模型肠道黏膜免疫应答水平的系统评估。方法 基于细胞膜表面分子标志物，包括分化簇（Cluster of differentiation, CD）45、CD3、CD4、CD19、CD38、CD45、CD69、CD185、程序性死亡受体1(Programmed cell death 1, PD-1)、趋化因子受体5(Chemokine receptor 5, CCR5)等，制定两套15色流式检测方案，分别用于评价肠道固有层T细胞与固有免疫细胞亚群以及用于评估固有层B淋巴细胞亚群。采用C57BL/6小鼠制备肠道固有层单个核淋巴细胞悬液，验证方案在评价小鼠肠道粘膜固有层免疫应答中的适用性。结果 应用所建立的流式方案，成功鉴定了包括活化T细胞、调节性T细胞、巨噬、NK、B、浆细胞等多个关键肠道固有层免疫细胞亚群，并通过检测刺激条件下T细胞亚群功能状态的特异性变化，实现对细胞免疫功能的精准评估。结论 本研究成功建立的两套多色流式方案适用于小鼠肠道固有层单个核淋巴细胞悬液样本，为监测小鼠模型肠道免疫微环境状态提供了可靠且高效的检测方案。
宿主蛋白FTH1与纳尔逊海湾正呼肠病毒σNS蛋白互作并促进病毒复制
路佩嘉;钟萍;曹珂铨;孙绿茵;马竹萍;李永刚;陶晓莉;纳尔逊海湾正呼肠病毒（Nelson bay orthoreovirus,NBV）是一种新兴的具有人畜共患潜能的病毒，可诱发人类呼吸道疾病。然而，对其潜在危险性尚不清楚，因此深入研究NBV复制机制对于理解其致病性具有重要意义。目的本研究旨在探讨宿主蛋白FTH1与NBVσNS蛋白相互作用（互作），阐明宿主蛋白对病毒复制的影响。方法构建真核重组质粒pFLAG-CMV-3-FTH1,Western blot验证其在细胞内的表达。将σNS-HA和FTH1-FLAG两种质粒共转至293T细胞中，利用免疫共沉淀和免疫荧光共聚焦验证σNS和FTH1蛋白互作。以NBV感染L929细胞，RT-qPCR检测FTH1基因在不同感染时间和不同MOI值的相对表达量变化；Western blot检测NBV感染后不同时间点FTH1的蛋白表达水平和不同MOI值NBV感染后48 h FTH1的蛋白表达水平通过灰度值分析比较蛋白表达差异。敲低FTH1基因并感染NBV ,Western blot检测σNS在感染后不同时间点的蛋白表达量变化并通过灰度值分析比较蛋白表达差异。结果 成功构建pFLAG-CMV-3-FTH1重组质粒，表达FTH1蛋白；验证σNS和FTH1蛋白互作；NBV感染促进FTH1在基因与蛋白水平的表达，且该促进作用具有时间依赖性；不同感染复数（MOI分别为0、0.01、0.1、1和5）的NBV感染均促进FTH1的表达，且在MOI 5的条件下FTH1蛋白表达量升高最明显；敲低FTH1基因，σNS表达量减低。结论 验证FTH1与σNS蛋白发生互作。FTH1通过与σNS相互作用，促进NBV的复制。研究结果为深入分析NBV复制进程中宿主蛋白与病毒蛋白的相互作用机制奠定了基础，也为探索NBV感染的潜在治疗靶点提供了重要思路。